Evaluación Final Curso De Métodos En Biotecnología

Alumno: Luis del Pozo Yauner

Tema: Métodos Electroforéticos

Introducción:

El nivel de desarrollo científico de las sociedades humanas ha sido estimado, por lo general, por la cantidad de conocimientos que atesoran, y la velocidad con que pueden generarlos. El conocimiento puede dividirse en dos grandes grupos: el que es mera descripción de nuestro entorno, sea este tan lejano como los mismos límites de nuestro universo, o tan cercano como las moléculas que nos componen; y el conocimiento “herramienta”, aquel que en forma de métodos, procedimientos y tecnologías, nos permite describir y sobre todo, modificar el entorno. Se reconoce, pues, un vínculo de génesis entre todas las partículas de conocimiento. El descriptivo se va convirtiendo en “herramientas”, y estas ayudan a generar nuevo conocimiento. La historia de las ciencias, y por consiguiente del hombre, ha sido también la historia del desarrollo de los métodos.

En el caso de la Biología, su desarrollo ha estado condicionado por el avance de los métodos para identificar, aislar y describir las propiedades de las moléculas que componen los sistemas vivos. Uno de los más poderosos y populares de estos métodos es la electroforesis, que dado su grado de diversificación actual, es propio hablar de “métodos electroforéticos”. Como concepto, “electroforesis” se refiere al movimiento que experimentan partículas cargadas, ya sean átomos individuales o grandes complejos moleculares, cuando son sometidas al efecto del un campo eléctrico. En este trabajo nos ocuparemos brevemente de su desarrollo histórico, de la descripción de los conceptos y principios básicos, así como de los métodos fundamentales usados en la actualidad, señalando algunas aplicaciones específicas de estos.

La historia se inicia con Tiselius:

En 1937 el bioquímico sueco Arne Tiselius dio a conocer un nuevo método para separar las proteínas de una mezcla. Este consistía en colocar un cierto volumen de una solución proteica, conteniendo dos o más de estas sustancias, en un tubo de vidrio en forma de “U”, sin llenar completamente este. Luego el espacio restante en cada extremo se ocupaba con el volumen necesario de una solución de electrolitos libre de proteína, que actuaba como amortiguador. Debía tenerse mucha precaución al adicionar la solución amortiguadora, evitando que se mezclara con la solución de proteínas a separar. Luego se sumergía un electrodo en la solución amortiguadora libre de proteína de cada extremo, se conectaban los electrodos a una fuente de electricidad y se sometía todo el sistema a una campo eléctrico. Los componentes de la mezcla de proteínas comienzan a moverse a diferente velocidad, en virtud del signo y el número global de cargas, hacia el electrodo de carga opuesta. Se formaban frentes de movimiento que reflejaban la movilidad electroforética de cada componente, o grupos de componentes de la mezcla, por lo que se le dio el nombre de “electroforesis de frentes en movimiento” o “moving boundary electrophoresis” a este sistema. Este fue uno de los pocos métodos analíticos poderosos disponibles para los investigadores en la época del desarrollo inicial de la química de proteínas; no obstante, presentaba importantes desventajas, como exigir gran cantidad de muestra, ser muy laborioso y en la práctica no permitir la separación total de los componentes de la mezcla. Las desventajas radicaban en su propia concepción; la separación electroforética ocurría en el medio fluido del amortiguador, sin un soporte que por su naturaleza limitara la mezcla convectiva de los frentes en movimiento, sobre todo, apenas se suprimía el campo eléctrico. Como consecuencia, el poder de resolución del método era escaso. El sistema de Tiselius dio paso a aquellos que usaban un soporte sólido, o gelatinoso, embebido en la solución amortiguadora de pH, y sobre el que ocurría la separación electroforética. En estos sistemas la muestra era constreñida a moverse en el seno del soporte, y dada las cantidades relativamente pequeñas de muestras que podían aplicarse, la separación total de los componentes en bandas o zonas discretas se convertía en algo realizable. Al desconectar el campo eléctrico, cada componente de la mezcla se mantenía por un tiempo suficiente para fines prácticos, en la zona del soporte que había alcanzado durante la electroforesis. Se les llamó genéricamente “electroforesis de zona”. Como puede suponerse, el soporte es un factor muy importante para este tipo de electroforesis. Uno de los primeros soportes usados fue el papel de filtro, pero tenían inconvenientes como su fragilidad y la escasa resolución que se alcanzaba en la separación, debido fundamentalmente al gran tamaño de sus poros moleculares. Luego, el papel fue sustituido por las membranas de acetato de celulosa. Este material posee menor tamaño de poro, lo que resulta en mayor poder de resolución, pero de igual manera es frágil, lo cual hace su manipulación laboriosa, y no permitía alta reproducibilidad de los resultados. Probablemente esto se debió a la dificultad de establecer adecuados controles de calidad en su manufactura. El acetato de celulosa, no obstante, tuvo amplia aplicación en los métodos electroforéticos usados en los estudios clínicos, y aún se usa en muchas instituciones de salud de varios países. Los geles han sido muy usados como soportes electroforéticos, y en la actualidad permanecen, en el caso de los geles de agarosa y de poliacrilamida, como los soportes de elección para la mayoría de las técnicas electroforéticas aplicadas en las investigaciones en Biología y ciencias afines. El gel de almidón, muy utilizado por la década de los años 50s-60s, incrementó la resolución para algunas aplicaciones, pero tiene inconvenientes, como rango limitado de poro, lo cual limita el tamaño molecular de las especies que pueden ser separadas, y además provoca intensa electroendoosmosis. Este fenómeno también fue una limitante en el uso de otro gel, el de agar. Hace relativamente poco tiempo, y gracias al desarrollo de metodologías de purificación, se hizo posible obtener agarosa de alta pureza a partir de ciertas algas productoras de agar. Con este polisacárido natural se confeccionan geles que, en dependencia de la concentración del reactivo usada, poseen rango de poros de variado tamaño, aunque la distribución práctica de poros es fundamentalmente hacia el rango de poro grande. La eliminación de los grupos cargados disminuyó considerablemente el fenómeno de electroendoosmosis. El gel de poliacrilamida, cuyo desarrollo se inició antes que el de agarosa, es, junto con este último, los soportes que poseen importancia práctica en la actualidad. Las ventajas fundamentales del gel de poliacrilamida son la posibilidad de seleccionar con suficiente exactitud el rango de poro, que en su conjunto es de menor talla que en el gel de agarosa; además, es un gel resistente, inerte y transparente; esta última propiedad es muy importante para su uso en ciertos sistemas ópticos de detección y estimación de la concentración de componentes separados por electroforesis en él. El desarrollo de los soportes electroforéticos hizo posible el diseño de nuevos procedimientos de separación de las biomoléculas y otras sustancias sobre la base a su carga eléctrica. Hoy son varios las técnicas que se valen de este principio, y constituyen valiosas herramientas en el laboratorio bioquímico. Las más conocidas son la electroforesis en gel de agarosa, la electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones nativas o desnaturalizantes, el enfoque isoeléctrico, la electroforesis bidimencional, la electroforesis en gel de campo pulsante y la electroforesis capilar. A ellas haremos referencia, en algunos casos brevemente, en este trabajo.

Referencia:

• Ninfa, A. J., & Ballou, D. P. Fundamental Laboratory Approach For Biochemistry and Biotechnology. Pps 125-156. Fitzgerald Scienc4e Press. Inc., Bethesda, MD.
• Voet, D., & Voet, J. (1995). Biochemistry. 2nd Edition, pps. 89-96. John Wiley & sons, Inc., New York.

Algunos Conceptos Básicos:

De inicio trataremos los conceptos básicos que se aplican a la mayoría de los métodos electroforéticos.

• Una molécula de carga q en un campo eléctrico E experimenta una fuerza (F):

F₌qE

• La movilidad electroforética (m) de una molécula es:

m _{= =}

Donde v es la velocidad de movimiento de la molécula, y f es su coeficiente friccional.

• Ley de Ohm:

V= P=VI=RI²

Donde V es voltaje, R es resistencia del conductor, I es intensidad de la corriente y P es potencia. Esta relación nos indica que si incrementamos la I de la corriente en el experimento electroforético, la P, y por consiguiente, el calor generado se incrementa al cuadrado.

• Dada la relación establecida en la ecuación:

P₌

Cuando disminuimos la fuerza iónica del amortiguador, y por tanto su conductividad, aumenta la resistencia (R) al paso de la corriente. Como consecuencia disminuye el calor generado por el sistema (P), si V se mantiene constante. Por cada dos veces que disminuyamos la fuerza iónica del amortiguador, podemos incrementar 1.4 veces el V sin provocar incremento significativo del calor generado

• La movilidad efectiva (m_eff) de un electrolito débil es un promedio de la movilidad efectiva de su forma ionizada:

m_eff=mx

Donde x es la fracción de moléculas ionizadas a un pH determinado, y m es la movilidad de la forma ionizada.

Referencias:

• Garfin, D. E. Electrophoretic Methods (1996). Reprinted from: Introduction to Biophysical Methods for Protein and Nucleic Acid Research. Edited by Jay A. Glasel and Murray P. Detscher. Academic Press.
• Ninfa, A. J., & Ballou, D. P. (1998) Fundamental Laboratory Approach For Biochemistry and Biotechnology, pps 125-156. Fitzgerald Science Press. Inc., Bethesda, MD.
• Voet, D., & Voet, J. (1995). Biochemistry. 2nd Edition, pps. 89-96. John Wiley & sons, Inc., New York.

Electroforesis en gel de agarosa:

La agarosa es un polisacárido lineal que se extrae de ciertas variedades de algas productoras de agar (FMC Bioproduct, 1988, Sambrook et al, 1989). La estructura básica que se repite a lo largo del polímero lineal es una unidad compuesta por una molécula de D-galactosa y una de 3,6 anhidrido galactosa, unidas por enlace glucosídico. Cuando la agarosa es hidratada y fundida a temperaturas altas y luego dejada enfriar, forma un gel en el que las cadenas polisacarídicas se entrelazan, en asociación física estabilizada por innumerables puentes de H, formando ases interconectador, que finalmente resultan en una densa red o malla cuyos poros moleculares limitan los espacios internos de la trama. Los poros del gel de agarosa son mayores que los del gel de poliacrilamida. En el gel de agarosa solo pueden ser separadas con eficiencia proteínas de peso molecular mayor de 500kDa, y moléculas de DNA de alrededor de 2000 pb. En la medida que se incrementa la concentración de agarosa en el gel, el tamaño de los poros disminuye.

En el mercado hay disponibles muchos tipos de celdas electroforéticas para realizar electroforesis en geles de agarosa. Igualmente, están disponibles muchos tipos de agarosas, que varían en sus propiedades químicas y físicas, como la intensidad de la electroendoosmosis que su composición química promueve, la resistencia mecánica del gel, la porosidad, y la temperatura de gelificación, que para algunas de grado especial es significativamente baja sin que se afecten otras características como la resistencia mecánica del gel. Estas propiedades influyen significativamente en los resultados del proceso de separación electroforética (Sambrook et al, 1989).

Aunque se ha usado en técnicas para proteínas, el uso más frecuente de la agarosa es en los métodos electroforéticos de separación de ácidos nucleicos. Varios factores determinan la velocidad de migración de una molécula de DNA en el gel de agarosa.

Estos factores son:

Tamaño molecular del DNA: Debido a la resistencia friccional que ejerce el gel sobre las moléculas de DNA que se mueven en su seno en respuesta al campo eléctrico, aquellas de mayor talla se moverán a una menor velocidad que las más pequeñas. La velocidad de migración es inversamente proporcional al log₁₀ del número de pares de bases, para el caso de una molécula de DNA de doble cadena y lineal.

Conformación del DNA: La forma o conformación del DNA influye significativamente en su movilidad electroforética. El DNA súper enrollado (forma I), el DNA circular mellado (forma II) y el DNA lineal de igual talla molecular migran a través del gel de agarosa a diferente velocidad. Si bien la concentración de agarosa del gel es el factor que primariamente determina la velocidad relativa de migración de estas formas, otros factores como la fuerza del campo eléctrico aplicado, la fuerza iónica de amortiguador y el grado de súper enrollamiento de la molécula en forma I, también influyen en el valor de este término (Johnson and Grossman, 1977). Bajo algunas condiciones el DNA en forma I migra más rápidamente que el III, pero en otras el orden se invierte.

Concentración de agarosa en el gel: Un fragmento de DNA lineal de un tamaño molecular dado migrará a diferentes velocidades en geles que posean diferente concentración de agarosa. La relación entre la movilidad electroforética (m) y la concentración del gel (t) se expresa en la siguiente ecuación:

logm=logm₀-K_r t

Donde m₀ es la movilidad electroforética libre del DNA, K_r es el coeficiente de retardo, una constante que se relaciona a las propiedades del gel y al tamaño y la forma de la molécula que migra. Esta relación nos dice que, modificando la concentración del gel, podemos resolver mezclas no totalmente separadas en un primer intento.

El rango óptimo de separación de geles de agarosa en dependencia de la concentración se indica en la tabla siguiente:

Cantidad de agarosa en el gel, expresado en % (p/v)	Rango óptimo de separación de fragmentos lineales de DNA (kb)
0,3	5-60
0,6	1-20
0,7	0,8-10
0,9	0,5-7
1,2	0,4-6
1,5	0,2-3
2,0	0,1-2

Voltaje aplicado: A bajo voltaje la velocidad de migración del DNA es proporcional al voltaje aplicado. Pero en la medida que el campo eléctrico es intensificado, la movilidad de las moléculas de DNA de alto peso molecular comienza a no corresponder proporcionalmente al incremento del voltaje. Como consecuencia, el rango efectivo de separación en el gel de agarosa disminuye con la elevación del voltaje. La máxima resolución en la separación de fragmentos de DNA de más de 2kb se logra cuando se realiza la corrida electroforética a 5 V/cm. La distancia a usar en este cálculo es la que separa en línea recta a los electrodos de la celda electroforética.

Dirección del campo eléctrico: Los fragmentos lineales de DNA se alinean con relación a la dirección del campo eléctrico, de modo que al cambiar la dirección de este, estos fragmentos deben realinealse para iniciar el movimiento en la nueva dirección del campo. Los fragmentos de mayor talla consumen más tiempo en el proceso de realineamiento, y quedan rezagados con relación a los de talla menor. El cambio frecuente de la dirección del campo eléctrico es la base de la electroforesis en gel de campo pulsante.

Composición de bases del DNA y la temperatura de corrida: La influencia de estos factores es menor en el gel de agarosa que en la electroforesis en gel de poliacrilamida, no obstante, en el caso de geles confeccionados con agarosa de bajo punto de fusión, o aquellos que contienen menos del 0,5% del polisacárido, es muy conveniente realizar el ensayo a 4⁰C, para evitar la fusión del gel.

Presencia de colorantes intercalantes: El colorante fluorescente intercalante Bromuro de Etidio reduce la movilidad electroforética del DNA lineal en un 15%. Este efecto se debe al intercalamiento de las moléculas del colorante entre las bases apiladas en la estructura del DNA, que torna rígidas y alargas a las moléculas lineales o circulares con mella.

Composición del amortiguador: la movilidad electroforética del DNA es afectada por la composición y la fuerza iónica de amortiguador usado en el ensayo. En cuanto a la fuerza iónica, su efecto es expresión de la relación entre este parámetro y la corriente eléctrica que fluye a través del gel. En un medio de fuerza iónica cero, la conductancia es mínima y la movilidad electroforética del DNA es escaza, si es que migra. En cambio, si la fuerza iónica del amortiguador es muy alta, el flujo de corriente se incrementa, lo que resulta en mayor generación de calor, lo que puede incrementar la temperatura del sistema más allá del punto de fusión de la agarosa, y eventualmente desnaturalizar el DNA. Fragmentos lineales de DNA de doble cadena migran alrededor de un 10% más rápido en amortiguador TAE que en TBE o TPE, sin que esto signifique incremento en la resolución. En cambio, la resolución de mezclas de DNA súper enrollado es mejor en TAE que en TBE.

Varios aparatos y protocolos han sido desarrollados para satisfacer las diferentes exigencias del trabajo experimental relacionado con la separación electroforética de mezclas de DNA. Información abundante sobre este particular se encuentra disponible en el web y textos de métodos.

Referencia:

• FMC BioProducts (1988) “FMC BioProducts Sources Books,” Agarose Monog., 4th ed., pp. 51-106. FMC BioProducts, Rockland, Me.

§ Garfin, D. E. Electrophoretic Methods (1996). Reprinted from: Introduction to Biophysical Methods for Protein and Nucleic Acid Research. Edited by Jay A. Glasel and Murray P. Detscher. Academic Press.

• Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989). “Molecular Cloning: A Laboratory Manual,” 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY.

Electroforesis en Gel de Poliacrilamida:

La casi inigualable resolución y flexibilidad que ofrece la electroforesis en gel de poliacrilamida ha convertido a esta técnica en una de las más usadas para la separación de proteínas y ácidos nucleicos. Es posible variar la porosidad del gel y la composición del sistema de amortiguadores para satisfacer una amplio rango de requerimientos experimentales. La separación puede realizarse en virtud de las diferencias de carga, del tamaño molecular, o por una combinación de ambos.

El gel de poliacrilamida se forma por la copolimerización de la acrilamida y un comonómero entrecruzante que es usualmente la N,N^’-metilenebisacrilamida (bisacrilamida). El entrecruzante es un agente acrílico bifuncional que une covalentemente las cadenas lineales de poliacrilamida (Righetti et al, 1989). Además de la bisacrilamida se han usado otros entrecruzantes para propósito especiales, como el piperazinediacrilamide, o PDA, que permite obtener un gel con bajo fondo en la coloración con plata.

La reacción de polimerización, representada en la figura situada debajo, es de adición de grupos vinilos, iniciada por un sistema generador de radicales libres (Flory et al, 1953).

En las recetas más comunes de confección de geles de poliacrilamida, la polimerización es iniciada por la adición de persulfato de amonio, que es el agente iniciador, y de tetrametiletilenediamina (TEMED), que funciona como agente acelerador. El TEMED acelera la descomposición del persulfato de amonio en radicales sulfato libres, los que inician la reacción al convertir a los monómeros de acrilamida en radicales libres que reaccionan, a su vez, con los monómeros no activados, procediendo de esta forma la polimerización; para esta se necesita la presencia de la base libre del TEME. La estructura del agente entrecruzante N,N^’-metilenebisacrilamida es la de dos moléculas de acrilamidas unidas a través de sus grupos amino por una unidad de metilene. Esta estructura le permite a una molécula de entrecruzante participar en la reacción de polimerización de dos cadenas lineales en crecimiento. Cuando esto ocurre, las cadenas lineales quedan conectadas covalentemente por un puente de Cs y Ns alternantes. Este puente posee dos enlaces C-N de tipo peptídico, lo cual probablemente aporta cierto grado de rigidez a la estructura. Cuanto mayor es la concentración relativa del agente entrecruzante, mayor es la probabilidad de que se entrecrucen las cadenas lineales de poliacrilamida, aunque esto parece ser verdadero hasta cierto valor de concentración, como veremos luego (Gelfi C et al 1981a).

Muchos factores influyen profundamente el curso de la reacción de polimerización, y si no son adecuadamente controlados, se pueden comprometer las propiedades del gel y Consecuentemente la reproducibilidad del ensayo electroforético. Entre estos factores destacan:

q Pureza de los reactivos: La presencia de impurezas como el ácido acrílico, iones metálicos y acrilamida lineal, tanto en la acrilamida como en la Bis, pueden inhibir la reacción de polimerización, y modificar las propiedades del gel.

q La concentración de los comonómeros: Los geles de poliacrilamidan son caracerizados convencionalmente por dos términos: El %T y el %C. El primero indica la concentración total de monómeros (acrilamida + bisacrilamida) expresadas en g/100mL de solución, y el %C indica la proporción relativa del entrecruzante en la concentración total de monómeros ([Acril+Bis]/[Bis]x100). El tamaño de poro efectivo del gel es una función inversa del valor de %T, lo cual significa que, a mayor valor de %T, para un valor fijo bajo de %C, menor el tamaño de poro. Por otra parte, la función que expresa la relación entre el valor de %C y el tamaño de poro es bifásica; puede ser representada como una campana invertida en un eje de coordenadas, donde x es %C e y es tamaño de poro. En la medida que se incrementa %C a un %T constante, disminuye en tamaño de poro, siendo este mínimo al valor de 5%C. A valores mayores de 5%C el tamaño de poro se incrementa (Gelfi C et al 1981a).

El rango de fraccionamiento con relación al valor de %T se representa en la siguiente tabla:

Rango de fraccionamiento para geles de poliacrilamida
%T	Rango Mr óptimo
5-12	20,000-150,000
10-15	10,000-80,000
> 15	<15,000

q El pH: Cuando el pH es menor de 6, la eficiencia de la reacción de polimerizaciòn disminuye significativamente (Caglio & Righetti, 1993). Una forma de atenuar este efecto cuando se necesitan confeccionar geles a pH ácido, es usar riboflavina como fuente de radicales libres adicional, y la luz como activador en presencia de O₂, de la liberación de estos radicales.

q La presencia de O₂: Puesto que la formación de poliacrilamida procede como una reacción de polimerización de radicales libres, la presencia de agentes que reaccionan con estos y los atrapan, la inhibe. El oxígeno es ese tipo de inhibidor. Por eso se hace necesario, para ciertos requerimientos, eliminar el oxígeno disuelto en las soluciones de reactivos mediante degasado. En ocasiones también se hace necesario aislar del aire circundante a la solución donde está ocurriendo la reacción de polimerización, mediante una fina capa de agua previamente degasada.

q Temperatura: En control de la temperatura es crítico para lograr reproducibilidad en la polimerización de la acrilamida. La temperatura tiene un efecto directo sobre la velocidad de la reacción de polimerización, pues esta es exotérmica. El calor liberado acelera, pues, a la reacción. La temperatura de polimerización también influye en las características finales del gel. El rango óptimo es de 23⁰C a 25⁰C. A temperaturas cercanas a cero se forman geles de aspecto turbio, porosos e inelásticos, y a temperaturas muy altas se forman cadenas poliméricas cortas y el gel también es inelástico (Gelfi, C. et al 1981b).

q Aditivos: Aditivos como los detergentes SDS y Tritón X-100 pueden adicionarse a la mayoría de los sistemas de amortiguadores sin que se altere la polimerización. En cambio, la formamida y la urea provocan la formación de geles con tamaño de poro menor que el que acontecería si no estuvieran estos reactivos presentes. Además de los propios aditivos, los contaminantes que en ocasiones les acompañan pueden también inhibir la polimerización.

q Tiempo: Si bien luego de transcurridos 15-20 min puede constatarse la formación del gel, la polimerización aún está procediendo. Se sugiere que cuando se emplee el sistema persulfato de amonio-TEMED, se permita que esta transcurra durante al menos 2 horas, para asegurar reproducibilidad en las características del gel. En cuanto al sistema riboflavina-luz, por lo general la reacción procede más lentamente, dependiendo de la intensidad de la luz.

La electroforesis en gel de poliacrilamida puede ser efectuada en condiciones no desnaturalizantes para las proteínas, y en ese caso se clasifica como “electroforesis en condiciones nativa”, o por el contrario, en “condiciones desnaturalizantes”, tales que aseguran total desnaturalización de estas. Esto es importante, pues si bien en ambos casos la fuerza que mueve a las moléculas cargadas a lo largo del gel es la atracción del polo con carga opuesta, la separación de los componentes de la muestra no ocurre por el mismo principio en ambos casos.

El sistema de amortiguadores tienen un efecto profundo en la corrida electroforética. El amortiguador determina las condiciones de potencia del sistema, y afecta la separación y resolusión de las bandas. Adicionalmente, cuando se desea realizar un experimento en condiciones nativas, es muy importante tener en cuenta el efecto de las características de fuerza iónica, composición de iones y pH del amortiguador sobre la actividad de las proteínas de la muestra.

Los sistemas de amortiguadores para electroforesis en gel de poliacrilamida se clasifican en continuos y discontinuos.

Sistema continuo: Es aquel en el que un mismo amortiguador, con el mismo pH, es usado en el gel y en los reservorios de los electrodos. Adicionalmente, las muestras son cargadas directamente en el gel donde ocurrirá la separación. Este sistema tiende a la difusión de las bandas, lo cual hace que tenga menor resolución que el sistema discontinuo. Cuando la concentración de los componentes de la muestra se acerca a 1mg/mL, este sistema puede ser usado.

Sistema discontinuo: El primer sistema discontinuo fue desarrollado por Ornstein y Davis en 1964. Este fue un sistema para el análisis de proteínas del suero en estado nativo, que desde entonces ha sido aplicado a muchas otras proteínas. Este sistema consiste en cuatro partes interrelacionadas: (1) el gel concentrador (stacking gel), (2) el gel separador (running gel), (3) el amortiguador de electrodos, y (4) la muestra. El gel concentrador es de poros grandes (4%T), contiene amortiguador Tris-Cl 0.125M, pH 6.8 y se prepara en la parte superior del gel separador. Este último posee valores de 5-30%T, contiene Tris-Cl 0.375M, pH 8.8. El amortiguador de los electrodos es Tris 0.025 Glicina 0.192M, pH 8.3. La muestra se deposita sobre el gel concentrador, diluida en amortiguador de muestra Tris-Cl 0.0625 M, pH 6.8, y es cubierta por el amortiguador del cátodo (reservorio superior). Cuando es aplicado el campo eléctrico, los aniones Cl^- y glicinato, así como las proteínas cargadas negativamente, comienzan a moverse hacia el ánodo. El Tris y otros cationes se mueven hacia el cátodo. Como la m_eff del Cl^- es mayor que la de la glicina a pH 8.3 (Dado que el pKa de la glicina es 9.8, solo 1/30 moléculas están disociadas a glicinato), se forma una región de baja conductividad y alto campo eléctrico detrás del frente de movimiento del Cl^-. Esto acelera el movimiento de las proteínas de la muestra y del frente de movimiento de la glicina a la misma velocidad del frente del Cl^-. Se forma un arreglo de frentes en movimiento, con el Cl^- al frente, la glicina en la retaguardia, y las proteínas en varios frentes comprimidos entre ambos. Esto ejerce un efecto de concentración de las proteínas que se ha planteado pueden llegar a alcanzar concentraciones del orden de 100mg/mL (Chen et al, 1978). El pH del gel concentrador asciende a 8.3 en la medida que la glicina se mueve a través de él. Dado que el gel concentrador posee poros grandes, no ejerce efecto de tamiz, y las proteínas avanzan solo dependiendo del efecto del campo eléctrico. Cuando los frentes atraviesan el gel concentrador y entran en el gel separador, la menor porosidad de este sí ejerce efecto de tamiz, resistiéndose al paso de las proteínas en dependencia de su tamaño molecular. Como este es un sistema en condiciones nativas, también la forma influye en la movilidad electroforética. A lo anterior debe añadirse que al penetrar las proteínas en el gel separador, experimentan un súbito cambio del pH del medio, de 8.3 a 8.8, el que luego asciende a 9.5 cuando el amortiguador Tris-CL es sustituido por Tris-glicina. Este es el valor de pH al ocurre la separación de los componentes de la muestra en bandas discretas.

Laemmlin en 1970 modificó es sistema de Ornstein-Davis para usarlo en la estimación del peso molecular de las proteínas. él incorporó el detergente aniónico dodecil-sulfato de Na (SDS) al 0.1% en los amortiguadores del sistema de Ornstein-Davis, y adicionó un paso de desnaturalización al calor en presencia de 0.2% de SDS y 2-mercaptoetanol al 5%. En tales condiciones, los enlaces S-S de las proteínas se reducen, y las proteínas se desnaturalizan totalmente. El SDS se asocia a estas en una relación de 1.4g de SDS por gramo de proteína. Las propiedades del SDS se hacen dominantes sobre las de las proteínas, estas adoptan una conformación extendida, similar a bastoncillos, con dimensiones proporcionales a su masa molecular. En adición, la densidad de carga del complejo SDS-proteína es independiente del pH en el rango de 7 a 9. Por todo lo dicho, se hace claro que el fraccionamiento de los componentes de la muestra depende únicamente del efecto de tamiz del gel de poliacrilamida, de modo que es posible estimar con buena exactitud la masa molecular de una proteína, si se posee varias de ellas de masa conocida (marcadores de peso molecular para SDS-PAGE), pues la relación entre la movilidad relativa de estas y el logaritmo de su peso molecular es lineal dentro de un rango relativamente amplio para cada sistema. Están disponibles en el comercio numerosos kits de proteínas de referencia de peso molecular, tanto para rango de peso bajo, alto, como rango amplio. En la tabla que sigue se muestra un ejemplo, comercializado por la compañía Bio-Rad, así como el gráfico donde se representa la relación lineal entre movilidad relativa relativa y log del peso molecular.

Aunque el formato más usado en la actualidad es el gel en forma de lámina, también se han desarrollado sistemas que emplean geles de forma tubular.

En las electroforesis en gel de poliacrilamida, para la detección de las bandas se emplean colorantes como el negro amido, el azul brillante de Coommassie, pero también coloraciones con mayor sensibilidad para detectar proteínas. Uno de los métodos más sensibles es la coloración con plata (Rabilloud et al., 1990). También se emplea la coloración con Cu cuando se desea evitar el paso de fijación en electroforesis de SDS-PAGE. La especificidad de reconocimiento de los anticuerpos permite identificar a componentes específicos de la muestra, separados durante la electroforesis, mediante el método de inmuno-fijación (immuno-blotting). Dado que los anticuerpos reconocen fundamentalmente epitopes conformacionales, su uso se limita a sistemas de electroforesis nativa.

Como veremos en el caso de la 2D-SDS PAGE, la electroforesis en gel de poliacrilamida puede combinarse con otros métodos, como el PCR, para detectar cambios puntuales en genes que pueden ser causa de enfermedad, como es el caso de la Fenilcetonuria (Michiels, L., et al.)

Referencias:

• Caglio, S & Righetti, P. G. (1993) On the pH dependence of polymerization efficiency, as investigated by cappillary zone electrophoresis. Electrophoresis 14, 554-558.
• Chen, D., Rodbard, D., Chrambach, A: (1978) Poliacrilamide gel electroforesis with optical scanning, using multiphasic buffer systems: The syack. Anal. Biochem. 89, 596-608.
• Davis, B. J. (1964) Disc electrophoresis. II. Methods and application to human serum proteins. Ann. N. Y. Acad. Sci. 121, 404-427.
• Flory, P. J. (1953) “Principles of Polimer Chemistry.” Cornell University Press, Ithaca, NY.

§ Garfin, D. E. Electrophoretic Methods (1996). Reprinted from: Introduction to Biophysical Methods for Protein and Nucleic Acid Research. Edited by Jay A. Glasel and Murray P. Detscher. Academic Press

§ Gelfi C and Righetti P. G. (1981a)Polymerization kinetics of polyacrylamide gels I. Effect of different cross-linkers, Electrophoresis 2, 213–219

• Gelfi C and Righetti PG, Polymerization kinetics of polyacrylamide gels II. Effect of temperature, Electrophoresis 2, 220–228 (1981b)
• Laemmli, U. K. (1970). Cleavage of structural proteinsdurind the assembly of the head og bacteriophage T-4. Nature, 227, 680

§ Michiels, L., François, F., Raus, J. (1999) Identification of Disease Causing Mutations in Phenylketonuria by Denaturing Gradient Gel Electrophoresis Using the DCode™ System. Bulletin 2377. Bio-Rad. www.bio-rad.com.

• Ninfa, A. J., & Ballou, D. P. (1998) Fundamental Laboratory Approach For Biochemistry and Biotechnology, pps 125-156. Fitzgerald Science Press. Inc., Bethesda, MD.

• Ornstein, L. (1964) Disc electrophoresis. I. Background and theory. Ann. N. Y. Acad. Sci. 121, 321-349.
• Rabilloud, T. (1990). Mechanism of protein silver staining in polyacrilamide gels: A 10-years synthesis. Electrophoresis 11: 785-794.
• Righetti PG et al., (1981) Polymerization kinetics of polyacrylamide gels. III. Effect of catalysts, Electrophoresis 2, 291–295.

• Voet, D., & Voet, J. (1995). Biochemistry. 2nd Edition, pps. 89-96. John Wiley & sons, Inc., New York.

Enfoque isoeléctrico:

Este es un poderoso método para separar las moléculas anfotéricas de una mezcla sobre la base del valor de su pI. Las proteínas son el caso mejor conocido de moléculas afotéricas. Ellas se cargan negativamente cuando el pH del medio es mayor que el valor de su pI, en cambio, cuando ocurre lo contrario, el pH<pI, entonces su carga neta es de signo positivo. En ambas condiciones las moléculas se moverán en un campo eléctrico, obviamente dirigiéndose hacia el electrodo de carga opuesta. Pero la esencia del método radica en la respuesta de las moléculas anfotéricas cuando el valor de pH del medio se iguala al valor de su pI. En esas condiciones las cargas negativas de la especie son compensadas por igual número de cargas positivas, resultando en carga neta igual cero. Cuando esto ocurre, la molécula deja de responder al campo eléctrico y se detiene en la región donde pH=pI. Para la realización del enfoque isoeléctrico es necesario establecer un gradiente lineal y estable de pH a lo largo del gel, cuyo rango de valores estará determinado por los pI de los componentes de la muestra que son de nuestro interés. Los soportes que se han usado para este método son, fundamentalmente, los geles de agarosa y el de poliacrilamida. Para el isoelectroenfoque analítico son deseables geles con tamaño de poro grande, como el de agarosa al 1% o el de poliacrilamida con 5% de T y 3% de C. Para establecer el gradiente se emplean moléculas pequeñas (alrededor de 300-1000 da) llamadas portadores sintéticos de anfolitos, los cuales son estructuralmente compuestos poliamino-policarboxilatos (Just et al, 1983). Estos compuestos son incluidos en la mezcla de monómeros precursores del polimero del gel, y posterior a la confección de este, son distribuidos a todo lo largo mediante la aplicación de un campo eléctrico. Ellos se distribuyen en un gradiente de pH que se incrementa monotónicamente del ánodo al cátodo (Laas et al, 1989). La pendiente del gradiente de pH es determinado por el intervalo de pH cubierto por la mezcla de anfolitos usada, y por la distancia entre los electrodos.

Para lograr buenos resultados en el ensayo de enfoque isoelétrico, un elemento clave es la selección del rango de anfolitos a usar, el cual, idealmente, debe ser centrado por el valor de pI de la proteína de interés. Esto aseguraría que la proteína enfocara en la zona lineal del gradiente.

El isoelectroenfoque es una técnica muy poderosa, que permite la separación de moléculas que difieren en su valor de pI por menos de 0,05 unidades de pH. Adicionalmente posee la característica de no provocar la desnaturalización de las proteína, lo cual a permitido desarrollar técnicas a nivel preparativo.

Posterior al enfoque de los componentes de la muestra, se ejecuta la etapa de detección, la que se realiza mediante el uso de colorantes con afinidad para proteína (Ej. Azul de Comassie y Negro Amido) o específicos para glicoproteinas o lipoproteínas.

Referencias:

§ Garfin, D. E. Electrophoretic Methods (1996). Reprinted from: Introduction to Biophysical Methods for Protein and Nucleic Acid Research. Edited by Jay A. Glasel and Murray P. Detscher. Academic Press.

• Just, W. W. (1983) Synthesis of carrier ampholytes for isoelectrric focusinf. In “Methods in Enzimology” (C. Hirs and S. Timasheff, eds.), Vol. 91, pp281-298. Academic Press, New York.
• Laas, T. (1989) Isoelectric focusing in gels. In “Protein purification. Principles, Hight Resolution Methods, and Applications” (J-C Janson and L. Ryden, eds), pp. 376-403. VCH, Weinheim.
• Ninfa, A. J., & Ballou, D. P. (1998) Fundamental Laboratory Approach For Biochemistry and Biotechnology, pps 125-156. Fitzgerald Science Press. Inc., Bethesda, MD.
• Voet, D., & Voet, J. (1995). Biochemistry. 2nd Edition, pps. 89-96. John Wiley & sons, Inc., New York.

Electroforesis Bidimensional:

Dado que cada método electroforético hace uso de, fundamentalmente, una propiedad física diferente de las moléculas de la muestra para lograr su separación, la combinación de dos de estos puede incrementar la capacidad de resolución del ensayo en general. Esta es la lógica de la electroforesis bidimensional, en la que se combinan dos técnicas que separan las moléculas en base a características diferentes. La combinación más frecuentemente usada es la de enfoque isoeléctrico con la electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS. A este ensayo de le ha denominado 2-D PAGE. Los dos principios de separación son ortogonales y complementarios. Primero las proteínas son separadas en bases a su pI en un ensayo de enfoque isoeléctrico, usando un solo carril de un gel en lámina, o un gel en forma cilíndrica. La separación ocurre en una sola dimensión. Luego la porción de gel que contiene las proteínas es cortada en una tira, en el caso de ser un gel en lámina, o el cilindro de gel es tomado, y en ambos casos se adosan al extremo superior de un gel para SDS-PAGE. El gel del enfoque isoeléctrico se orienta de modo tal que el eje de movimiento de las proteínas durante el enfoque queda perpendicular a la dirección de movimiento durante la SDS-PAGE. Luego se realiza la segunda corrida, de modo que ahora la separación ocurre en una segunda dimensión, perpendicular a la anterior. Una vez concluida la separación electroforética, se efectúa el paso de identificación mediante coloraciones estándar para proteína, o especiales, según el interés. El uso de la coloración de plata aporta mucha sensibilidad de detección al método. El resultado final va ha depender de las condiciones elegidas para cada ensayo; como, por ejemplo, el rango del gradiente de pH usado en el ensayo de enfoque isoeléctrico.

La combinación de ambos métodos incrementa significativamente la resolución, y hace posible resolver mezclas muy complejas de proteínas. Esta característica ha convertido a la 2D-PAGE en una herramienta muy poderosa para la identificación de nuevas proteínas, y el estudio de los patrones de expresión de estas en la célula, bajo condiciones específicas, lo cual es muy importante en la comprensión de nuestro proteoma.

Referencias:

§ 2-D Electrophoresis for proteomics. A Method and Products Manual. Bulletin 2651. Bio-Rad. www.bio-rad.com.

• Hoving, S., Voshol, H., van Oostrum, J. (2001) High-Performance 2-D Gel Electropho resis using Narrow pH-Range ReadyStrip^- IPG Strips. Bulletin 2587. Bio-Rad. www.bio-rad.com
• Pandey, A., Mann, M. (2000). Proteomics to study genes and genomes. Nature, 405(15):837-846.

Electroforesis Capilar (EC):

La EC es una familia de técnicas relacionadas que emplean capilares de pequeño diámetro interior (20-200mm) como celda donde estará contenido el sistema de amortiguadores donde ocurrirá la separación electroforética de los componentes de la muestra. Este formato permite acometer la separación, con muy alta eficiencia, de moléculas de estructura química muy diferentes, como proteínas y péptidos, DNA y carbohidratos. También es posible separar moléculas estructuralmente muy similares entre sí, como los enantiómeros, y pequeñas del tipo de los compuestos farmacéuticos. Las prestancias de este conjunto de técnicas se deben, en buena medida, al uso de alto voltaje, lo cual genera dentro del capilar tanto flujo electroforético de las especies iónicas de la muestra, como electroosmótico de la solución amortiguadora. Las altas propiedades de separación y los electroforegramas que resultan, recuerdan a un híbrido entre la SDS-PAGE y la HPLC.

Las características generales y ventajas que supone el uso de la EC se pueden resumir en:

• Emplea un tubo capilar donde ocurre la separación electroforética.
• Utiliza campos eléctricos de muy alta tensión, de hasta 500 V/cm.
• Usa metodología de detección muy moderna, que le dan al electroforegrama semejanza a un cromatograma.
• Posee un grado de eficiencia del orden de la cromatografía de gas en capilar , llegando a superarla en algunos casos.
• Requiere cantidades de muestra muy pequeñas, lo cual le convierte en un procedimiento analítico muy útil para el trabajo con sustancias muy escasas y valiosas.
• Su explotación es económica, pues consume pequeñas cantidades de reactivos.
• Es aplicable a un amplio grupo de compuestos, superando en este rubro a muchos otros métodos electroforéticos.

La configuración instrumental básica para la EC es simple, y consta de los siguientes elementos:

a) Un tubo capilar de sílice fundida que posea una ventana óptica para el análisis del contenido.

b) Una fuente de alto voltaje regulable.

c) Un par de electrodos.

d) Dos reservorios de solución amortiguadora.

e) Un detector de UV.

Cada extremo del capilar es sumergido en uno de los reservorios de amortiguador, y la ventana óptica es alineada con el detector. Luego de llenar el capilar con solución amortiguadora, la muestra puede ser introducida en él sumergiendo el extremo opuesto al que posee la ventana óptica en la solución de muestra, y posteriormente elevando este extremo unos 30 cm por encima del nivel del reservorio del extremo del detector. Ya introducida la muestra, se aplica el campo eléctrico y se procede a la separación electroforética. De hecho, la mayoría de los trabajos realizados en EC antes de 1988 se valieron de sistema confeccionados por los mismos investigadores. Los sistemas comerciales modernos se caracterizan, sobre todo, por su alto grado de automatización, conferido por el control computarizado de todas las operaciones, como la inyección electrocinética de la muestra, el control exacto de la presión y la temperatura del sistema, el desarrollo de los procedimientos y las estrategias de separación; poseen eficaces sistemas de disipación de calor y de recolección de fracciones.

Es necesario precisar el uso de algunos términos en el contexto de la electroforesis capilar. Los fundamentales son:

Tiempo de migración (t_m): Es el tiempo que toma a un soluto en moverse desde el inicio del tubo capilar hasta la ventana óptica del detector.

Movilidad electroforética (m_ep): Se expresa en cm²/Vs y es la velocidad con que se mueve un ion a lo largo del capilar en respuesta a la intensidad del campo eléctrico.

Velocidad electroforética (V_ep): Se expresa en cm/s, y es la distancia que recorre un soluto por unidad de tiempo.

Fuerza del campo eléctrico (E): Se expresa en V/cm.

La relación entre estos términos es la siguiente:

m_{ep = = (1)}

La V_ep se calcula dividiendo la longitud del capilar (L_d) entre el valor de t_m. La m_ep se calcula dividiendo la V_ep entre E. La V_ep es independiente del voltaje y de la longitud del capilar, pero es altamente dependiente del tipo de amortiguador empleado, el pH y la temperatura.

Las dos medidas del capilar que son importantes son L_d, que es la longitud del capilar desde su inicio hasta la ventana del detector, y la longitud total (L_t), que incluye el segmento de capilar que continúa luego de la ventana del detector, y que sirve para conectar al capilar con el reservorio de amortiguador. La separación mensurable ocurre en el segmento L_d, mientras que el cálculo de E se realiza dividiendo el voltaje total entre L_t.

La ecuación 1 nos permite calcular la m_ep aparente, pero el cálculo de la real debe tener en cuenta el efecto del flujo electroosmótico. Este factor debe ser cuidadosamente controlado durante los experimentos de separación, para lograr alta reproducibilidad.

La electroosmosis: Es uno de los procesos determinantes de la separación de los componentes de la muestra en la EC. Este fenómeno es consecuencia de los grupos ionizables presentes en la superficie interna de las paredes del capilar. La sílica fundida posee grupos silanol que están en contacto con el amortiguador contenido en el capilar. El grado de ionización de estos grupos depende del pH del amortiguador empleado en el ensayo. La sílica posee un pI de 1.5. A pH por encima de 1.5 la sílica se carga negativamente, y atrae cationes componentes del amortiguador, lo cual crea una doble capa de iones. Cuando se aplica un campo eléctrico a lo largo del capilar, la tendencia es que los aniones se muevan hacia el ánodo, y los catones hacia el cátodo, pero los grupos silanol de carga negativa están fijados en la pared del capilar y non pueden moverse libremente, pero los cationes de la doble capa, que si pueden hacerlo, se mueven hacia en cátodo, y en su movimiento arrastran moléculas de agua. El resultado es un flujo neto de solución amortiguadora en dirección al electrodo negativo, que puede ser muy intenso. A pH igual a 9.0 en amortiguador borato 20 mM el flojo electroosmótico (FEO) es de alrededor de 2mm/s, lo que en un capilar de 50 mm de diámetro interno significa un flojo neto de 4 nL/s. A pH igual a 3 el FEO es mucho menor, de 0.5 nL/s, lo que está determinado por el menor grado de ionización de los grupos silanol de la pared capilar. El FEO (V_eo) es definido por la siguiente relación:

V_{eo =}

Donde Î es la constante dieléctrica del medio, h es la viscosidad del amortiguador, y z es el potencial zeta medido en el plano de corte cerca de la interfase líquido-sólido. El z está relacionado al inverso de la carga por unidad de área de superficie, al número de electrones de valencia, y a la raíz cuadrada de la concentración de electrolito. Puesto que esta es una relación inversa, el incremento de la concentración de electrolitos resulta en la disminución del FEO.

El FEO puede ser controlado, o incluso suprimido, para realizar ciertos modos de ensayo de EC. Por otro lado, el FEO permite el análisis simultaneo de aniones, cationes y especies neutras en una misma corrida electroforética. A pH neutro o alcalino el FEO es suficientemente intenso como para obligar a todas las especies a moverse hacia el ánodo. El orden de movimiento es: Cationes, especies neutras y finalmente aniones.

Para describir el efecto del pH sobre el FEO y la movilidad de las especies ionizables de la muestra, emplearemos el caso de péptidos. Los péptidos son zwitteriones; a pH muy alcalino se cargan negativamente, y se mueven hacia el electrodo positivo (ánodo) en respuesta al campo eléctrico. Pero a pH alcalino el FEO es tan intenso que sobrepasa el efecto de atracción que ejerce el ánodo sobre los péptidos, y estos se mueven junto al amortiguador hacia el cátodo. A pH ácido, los péptidos se cargan positivamente, y el FEO es débil. Como resultado. ambos, los péptidos y el amortiguador fluyen hacia el cátodo.

Para asegurar el total control del sistema se hace necesario medir la intensidad del FEO. Un modo de calcularlo es inyectando una muestra que contenga una molécula neutra, como el metanol o la acetona, y midiendo el tiempo que le toma en llegar hasta el detector.

Para realizar modalidades de EC que se basan en el enfoque isoeléctrico (EI-EC) y la isotacoforesis (ISF-EC), se necesita eliminar el efecto de FEO. Ello se logra recubriendo la superficie interna del capilar con una sustancia no cargada, o usando capilares de teflón, que no poseen grupos químicos ionizables. También se han usado aditivos como la metilcelulosa.

Cinética del flujo:

Una consecuencia importante del uso del campo eléctrico como generador del flujo de amortiguador (FEO) en la EC, en lugar de los sistemas hidrodinámicos como las bombas de presión que se usan en los sistemas de cromatografía líquida, es que, en este último caso, el flujo posee un perfil de tipo laminar o parabólico, como consecuencia de la caída de presión que provoca la fricción de las moléculas del fluido con la superficie interna de los empaques y las paredes de las tuberías. Se establece un gradiente de flujo en el que la velocidad es mayor en las capas centrales del fluido y se aproxima a cero en las capas cercanas a la interfase líquido-sólido. Este gradiente de velocidad provoca que la banda o zona donde se mueve cada componente de la muestra se haga más ancha. Por el contrario, en los sistemas en los que el campo eléctrico es quien provoca el flujo, la fuerza impulsora del FEO se distribuye uniformemente a todo lo largo del capilar, y en consecuencia, no se producen caídas de presión. La velocidad de flujo es uniforme en toda la sección transversal del capilar, excepto en la región muy cercana a la interfase líquido-sólido, donde la velocidad también se aproxima a cero.

Eficiencia del sistema:

La velocidad de migración, (Vep), se calcula según la ecuación:

n_ep= m_ep E = m_ep

Donde V es el voltaje y L es la longitud total del capilar. El tiempo de migración (t) es:

t = ₌

Durante la migración a través del capilar ocurre dispersión de los picos (s²) como consecuencia de la difusión molecular. La s² se calcula a partir de la ecuación:

s²₌ 2D_mt₌

Donde D_m es el coeficiente de difusión del soluto (cm²/s). El número de platos teóricos (N) está dado por la relación siguiente:

N₌

Sustituyendo la ecuación de dispersión en la ecuación de cálculo de los platos teóricos, tenemos la siguiente relación:

N ₌

Sustituyamos los valores de la mioglobina de corazón de caballo en la ecuación para el cálculo del número de platos teóricos.

MW=13,900, m_ep=0.65x10^-4 cm²/Vs (en amortiguador bicina/TEA 20mM, pH=8.5)

D_m= 10^-6 cm²/s, V=30,000 Volts.

El cálculo de N es igual a 975x10³ platos teóricos.

La dispersión en un sistema simple como el que analizamos aquí, se asume como difusión dependiente del tiempo solamente. Esta ecuación indica que las moléculas grandes como las proteínas y los Ac. Nucleicos, con coeficientes de difusión (D) pequeños, generarán el número mayor de platos teóricos. Un modo de incrementar la eficiencia en el sistema de EC es incrementando el voltaje, lo cual disminuye el tiempo de separación. El voltaje límite en los sistemas actuales es de 30kV. No obstante la posibilidad de usar capilares muy cortos para generar campos muy fuertes, el límite práctico para el incremento de la fuerza del campo eléctrico es la generación de calor, que se denomina “calentamiento de Joule”. El calentamiento de Joule es consecuencia de la resistencia del amortiguador al flujo de la corriente eléctrica. Esto puede ser atenuado mediante el uso de sistemas apropiados de disipación de calor, aunque con límites reales.

No obstante las limitaciones que establece la difusión, la EC es un método útil para la separación de moléculas pequeñas, pues, dado que el valor de m_ep es una función de la relación carga / masa, las moléculas pequeñas tienden a tener mayor valor de m_ep.

La resolución (R_s):

La resolución entre dos especies componentes de la muestra se calcula mediante la ecuación:

R_{s =}

Donde ∆_ep es la diferencia de movilidad electroforética entre los dos componentes, m_ep es el promedio de la movilidad electroforética de ambas especies y N es el número de platos teóricos. Si sustituimos el conteo de platos teóricos en la ecuación de resolución, se obtiene:

R_s= (0.177)

Esta relación demuestra que incrementando el voltaje es una medida limitada para incrementar la resolución, pues para lograr el doble de la resolución es necesario incrementar el voltaje al cuádruplo. La clave de cualquier acción para incrementar la resolución radica en ∆m_ep. La mejor forma de controlar la movilidad de los distintos componentes de la muestra es eligiendo la modalidad de EC apropiada unido a la selección del sistema amortiguador adecuado.

La producción de calor durante los ensayos de EC es un fenómeno inevitable, dado el uso de campos eléctricos intensos. Los dos problemas fundamentales que provoca la generación de calor son:

§ Gradientes de temperatura a través de la sección transversal del capilar.

§ Cambios de la temperatura del sistema en función del tiempo (consecuencia de la disipación ineficiente del calor generado).

Dado la siguiente relación:

=

El calor generado es proporcional al cuadrado de la intensidad del campo eléctrico. Por consiguiente, disminuyendo la intensidad del campo o incrementando la longitud del capilar, se disminuye dramáticamente el calor generado.

Una consecuencia de la disipación del calor producido es el gradiente de temperatura antes mencionado. Dado que el calor se disipa por difusión, es de esperar que la temperatura en la zona central del capilar sea mayor que en las paredes del capilar. Como la viscosidad disminuye con el aumento de la temperatura, tanto el FEO como la m_ep se incrementarán para las moléculas que están en las capas de fluido más centrales en el capilar. La consecuencia es un perfil de flujo similar al hidrodinámico, con incremento del ancho de zonas o bandas de migración de las especies. El uso de capilares de muy pequeña sección transversal mejora la situación, al disminuir en el cuadrado del radio del capilar la corriente que pasa a través de él, y al mejorar la disipación del calor generado. La relación entre gradiente térmico (∆T), radio del capilar (r), la potencia disipada (W) y la conductividad térmica (K) se expresa en la siguiente ecuación:

∆T= 0.24

El segundo problema, el incremento de la temperatura en función del tiempo, se debe a la diferencia entre la velocidad de disipación y de generación del calor. La variación de la temperatura resultante modifica la viscosidad del fluido y por consiguiente los factores que determinan el tiempo de migración de las moléculas. La solución del problema depende tanto del uso de capilares estrechos como del acoplamiento de sistemas de enfriamiento, que pueden ser por aire o por líquido. La limitante en el uso de capilares de pequeño diámetro interno es que al disminuir este también disminuye el path length y consecuantemente el límite de detección.

La EC, como antes se mencionó, comprende una familia de técnicas que poseen diferencias dramáticas en cuanto a operatividad y características de separación. Estas técnicas son:

a. Electroforesis capilar de zona.

b. Enfoque isoeléctrico.

c. Electroforesis capilar en gel.

d. Isotacoforesis.

e. Cromatografía capilar miscelar electrocinética.

Dado los objetivos de este trabajo, nos ocuparemos de la descripción breve de las cuatro primeras técnicas.

Electroforesis capilar de zona: Es la forma más simple de EC, y se le conoce también como EC de solución libre. El mecanismo de separación es basado en las diferencias de la relación carga / masa de los componentes de la muestra. Dos factores, la homogeneidad de la solución amortiguadora y la constancia de la intensidad del campo eléctrico son claves para lograr buenos resultados con esta técnica. Luego de la inyección de la muestra y aplicado el campo eléctrico, los componentes de la mezcla se separan en zonas discretas. El parámetro fundamental, m_ep, puede ser aproximado a partir de la teoría de Debeye-Hunckel-Henry:

m_ep=

donde q es la carga neta, R es el radio de Stokes, y h es la viscosidad del medio.

La EC de zona es muy útil para el análisis de mezclas de proteínas, como las proteasas, y péptidos, pues es posible lograr la completa separación de, por ejemplo, proteínas que solo difieren en un residuo de aminoácido. Esto puede ser muy importante en el análisis de los mapas trípticos, haciendo posible la detección de modificaciones post-traduccionales y mutaciones puntuales. La EC se ha usado como método micropreparativo para separar los productos de la digestión de proteínas que serán secuenciadas. La cuantificación de mRNA celular, el análisis de los productos de PCR y de mezclas de fragmentos de DNA de doble cadena son otras de las aplicaciones de esta técnica. También es posible monitorear la formación de puentes disulfuros en péptidos durante el plegamiento. Otras aplicaciones son la separación de cationes y aniones inorgánicos y de productos farmacéuticos, siempre que sean especies cargadas.

Enfoque isoeléctrico (EI): Como para la técnica antes descrita en geles de poliacrilamida o agarosa, la premisa fundamental de esta técnica es que las moléculas migrarán en el campo eléctrico mientras posean carga. Apenas se haga una especie neutra, detendrá su migración. La separación en el enfoque isoeléctrico se realiza en un gradiente de pH generado por una serie de compuestos zwitterionicos conocidos como anfolitos. El gradiente de pH es menor en el ánodo y mayor en el cátodo. Cuando es aplicado el campo eléctrico, la mezcla de anfolitos se distribuye a lo largo del capilar, los de carga positiva se dirigen hacia el cátodo, y los negativos se mueven hacia el ánodo. El resultado es que el pH disminuye en la región del ánodo y se eleva en la región del cátodo. La migración de cada especie de anfolito cesa cuando alcanza la zona cuyo pH es igual a si pI. Los solutos componentes de la muestra migrarán en el campo eléctrico de igual forma, hasta encontrar la zona de pH igual a su pI, siendo este el mecanismo de separación. Como en el enfoque isoeléctrico para geles, las dos etapas iniciales del experimento son la carga de la muestra y el enfoque, pero en la técnica de formato EC es necesaria una fase adicional, que es la movilización. Luego del enfoque de los componentes de la mezcla, es necesario hacerlos pasar por la ventana óptica del detector, y esto se logra adicionando NaOH/NaCl en el reservorio del cátodo, lo cual provoca la movilización en dirección catódica; en cambio, si se adiciona NaCl en el reservorio del ánodo, se provocará la movilización en dirección anódica. La adición de sales altera el pH y esto provoca la movilización de las especies, ahora nuevamente cargadas, pero manteniendo el patrón de zonas de la etapa de enfoque.

El poder de resolución del enfoque isoeléctrico (∆pI) se describe en la ecuación siguiente:

∆pI=

Donde D es el coeficiente de difusión, E es la fuerza del campo eléctrico y m es la movilidad electroforética de la proteína. Se ha calculado un poder de resolución teórico de hasta 0.02 unidades de pH.

Dado su alto poder de resolución, el enfoque isoeléctrico es un poderoso método de análisis de proteínas, como anticuerpos monoclonales y factores de crecimiento; se ha usado en la identificación y cuantificación de hemoglobinas anormales, y además de para el cálculo del pI de péptidos y proteínas. Es muy útil para separar variantes de inmunoglobulinas, de Hb y para identificar modificaciones post-traduccionales de proteínas recombinantes.

Electroforesis capilar en gel (ECG): El gel que se usa en esta técnica es el de poliacrilamida, y se aplican las mismas consideraciones antes mencionadas para la EGPA , incluyendo la EGPA-SDS para las proteínas. Se usan capilares de entre 50 a 100 mm de diámetro interno, y entre 10cm y 1 m, aunque el tiempo de corrida se extiende excesivamente en el caso de los capilares muy largos. La fuerza del campo eléctrico es limitada a valores de 500 V/cm, y la resolución puede incrementarse manipulando la composición del gel. Los geles de agarosa no se han podido usar en esta técnica por la temperatura relativamente elevada que puede alcanzar el sistema, dado el voltaje que se usa. Esta técnica puede usarse para la separación de diferentes muestras de DNA, siempre que se pueda lograr el tamaño de poro adecuado en el gel de poliacrilamida, según el MW de las especies de DNA presentes en la muestra.

Isotacoforesis (ITF): Fue la técnica más ampliamente usada en el formato capilar antes de 1981, en la que se empleaban capilares de 250-500 mm, muy gruesos para los estándares actuales. Como para el enfoque isoeléctrico, se requiere eliminar el fenómeno de flujo electro-osmótico, y también usa un sistema heterogéneo de amortiguadores. En esta técnica, el capilar es llenado con una solución de electrolitos cuya movilidad electroforética en las condiciones de corrida es mayor que la de todos los componentes de la muestra, a ese electrolito se le nombra electrolito líder. Luego se inyecta la mezcla de componentes a separar, y finalmente se adiciona al reservorio opuesto una solución de electrolitos cuya movilidad electroforética en las condiciones de corrida es menor que la de todos los componentes de la muestra, a ese electrolito se le nombra electrolito terminador. Al establecerse el campo eléctrico, todas las especies cargadas se moverán en dependencia del signo de su carga (que para los fines de esta técnica ha de ser igual en todos los componentes) y de su movilidad electroforética. Por la diferencia en este último parámetro entre el electrolito líder y el electrolito terminador, se forma una brecha que es ocupada por los componentes de la muestra. La separación de los analitos ocurre en función de su movilidad electroforética, distribuyéndose estos en zonas o bandas estables bien definidas, lo que resulta en una muy eficiente separación. Dado que las bandas de movimiento de dos compuestos contiguos están en contacto (pues de separarse estas se formaría una zona de no-conductividad, y cesaría en campo eléctrico), se han usado compuestos con movilidad electroforética intermedia entre dos componentes que se desea separar totalmente. Estos componentes son nombrados espaciadores, y poseen como característica adicional no absorber en la longitud de onda donde se realizará la lectura de los componentes de interés.

Referencias:

§ Introduction to capillary electrophoresis. (1999) Beckman.

§ Lux, J. A.; Yin, H. F.; Schomburg, G., (1990) Construction, evaluation and analytical operation of a modular capillary electrophoresis instrument, Chromatographia 30, 7-15

• Lux, J. A.; Yin, H. F.; Schomburg, G., J. (1990) A simple method for the production of gel-filled capillaries for capillary gel electrophoresis, High Resolut.Chromatogr. 13, 436-437
• Paulus, A.; Ohms, J. I., (1990) Analysis of oligonucleotides by capillary gel electrophoresis, J. Chromatogr. 507, 113-123

§ McCormick, R. M., (1988) Capillary zone electrophoretic separation of peptides and proteins using low pH buffers in modified silica capillaries,., Anal. Chem.60, 2322-2328

• Compton, S.W.; Brownlee, R. G (1988) Capillary electrophoresis,., BioTechniques 6, 432-440
• Cohen, A. S.; Paulus, A.; Karger, B. L., (1987) High-performance capillary electrophoresis using open tubes and gels, Chromatographia 24, 15-24
• Altria, K. D.; Simpson, C. F., (1988) The effect of electrolyte chain length on electroendosmotic flow in high voltage capillary zone electrophoresis, Anal. Proc. (London) 25, 85.